Выработка перекрестно-реактивных антител к консервативным эпитопам на шиповидном белке SARS-CoV-2 после заражения и вакцинации

Филогенетическая конструкция

Аминокислотные последовательности спайкового белка для соответствующего вируса были собраны из базы данных белков NCBI (дополнительная таблица 3). Множественное выравнивание последовательностей (MSA) было выполнено с использованием MUSCLE (v3.8.1551).67.

RAXML (v2.0) использовался для создания филогенетического дерева максимального правдоподобия с моделью замещения Blosum62 и 100 повторениями.68. Окончательная визуализация филогенетического дерева была сделана с использованием набора инструментов Environment for Tree Exploration (ETE).69.

Человеческие предметы

Информированное согласие было получено от всех субъектов и / или их законного опекуна (ов). Это исследование было рассмотрено и одобрено RBI Children’s Mercy (№ 00001670 и № 00001317). Участники самостоятельно зарегистрировались после того, как ознакомились с информационным письмом об исследовании и получили возможность задать вопросы. Все методы применялись в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами, рассмотренными и одобренными RBI. Медицинские работники нашей детской больницы были зарегистрированы до введения вакцины Pfizer BNT162b2 SARS-CoV-2. Плазму из периферической крови собирали перед вакцинацией в качестве исходного уровня (0-я неделя), после первичной иммунизации (3-я неделя) и после второй иммунизации (7-я неделя) у лиц с неизвестным анамнезом инфекции (n = 140). Выборка состояла в основном из взрослых белых женщин среднего возраста, которые не идентифицировали себя как латиноамериканцев или латиноамериканцев (дополнительная таблица 1). Биообразцы вакцины Pfizer-BioNTech BNT162b2 были собраны в ходе исследования в Children’s Mercy Kansas City.

Биообразцы реконвалесцентов COVID-19 были получены через Precision for Medicine (ProMedDx, LLC, Нотрон, Массачусетс, США) и были собраны в рамках клинического исследования, которое было рассмотрено Институциональным/Независимым наблюдательным советом (IRB) и/или Независимым комитетом по этике IEC. ) в соответствии с требованиями местных регулирующих органов, включая кодексы федеральных правил Министерства здравоохранения и социальных служб (DHHS) и Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) по защите людей (45 CFR, часть 46 и 2l CFR, часть 46). 56 соответственно). 24 выздоравливающих человека с лабораторно подтвержденной ПЦР инфекцией SARS-CoV-2 были приобретены у Precision for Medicine (Bethesda, MD, USA). Сыворотку или плазму выделяли из сбора цельной венозной крови и хранили в замороженном виде в морозильных камерах со сверхнизкой температурой до использования для проведения иммунологических анализов.

Иммуноферментные анализы на спайковые антигены

ИФА проводили с использованием следующих антигенов: SARS-CoV-1 (кат. № 10683-CV, лот № DOXT0120121, R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США), SARS-CoV-2 (кат. № 10549-CV, лот № DODR0221011, R&D Systems), CoV летучих мышей RaTG13 (кат. № 10660-CV, лот № DOWW0120121, R&D Systems), шиповидный белок MERS-CoV (кат. № 40069-V08B, лот № LC14AP2305, Sino Biological, Wayne, PA, USA), человеческий CoV Спайковый белок NL63 (кат. № 40600-V08H, лот № LC14NO2607, Sino Biological), спайковый белок CoV 229E человека (кат. № 40605-V08H, лот № LC14AP2302, Sino Biological), спайковый белок CoV HKU1 человека (кат. № 40021-V08H, Лот № LC14AP2707, Sino Biological), шиповидный белок человеческого CoV OC43 (кат. № 40607-V08H, лот № LC14DE1609, Sino Biological) разбавляли до 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонате натрия и инкубировали на чашках с высоким связыванием (3369, Corning Inc, Корнинг, штат Нью-Йорк, США) ночью при 4 градусах. Сыворотку или плазму разводили до 1:30 в суперблочном буфере с азидом натрия с последующими разведениями 1:3 до конечного разведения 1:21870. Вторичные антитела были приобретены у компании Jackson ImmunoResearch (Вест-Гроув, Пенсильвания, США): козий антимышиный IgG (кат. № 115-035-003, лот № 153294) и козий античеловеческий IgG (кат. № 109-036-098, лот № 153294). № 149163). Вторичные разведения антител проводили в буфере суперблока без азида натрия в пределах диапазона рекомендаций производителя при разведении 1:50000. Добавляли субстрат SureBlue Reserve Microwell Substrate (95059-294, VWR, Рэднор, Пенсильвания, США) и инкубировали в темноте в течение 15 мин. Поглощение измеряли при 450 нм сразу после добавления в планшет 0,33 н. раствора HCl Acid Stop. Порог положительного результата определяли, используя трехкратное значение OD450 лунки отрицательного контроля без плазмы.

Производимый ИФА

Детекцию и количественную оценку антител класса S1 IgG проводили с использованием набора для высокочувствительного ИФА SARS-CoV-2 S1 IgG (41A232, Biovendor, Эшвилл, Северная Каролина, США) в соответствии со стандартным протоколом с сывороткой или плазмой, разбавленной 1:100.

Массив шиповидных пептидов SARS-CoV-2

Образцы плазмы разбавляли 1:200 и использовали для исследования одного белка и пептида SARS-CoV-2 на микроматрице (CDI Labs, Mayaguez, Puerto Rico). После зондирования матриц сывороточными антителами матрицы промывали, метили вторичным антителом Alexa 647 против IgG Fc человека и сканировали с использованием сканера GenePix 4000B (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, США). Данные массива были собраны с использованием программного обеспечения MAGPIX (Innopsys, Чикаго, Иллинойс, США). Каждый белок или пептид был представлен на микроматрице в трех экземплярах. Были белки положительного контроля (человеческий IgG, античеловеческий IgG и ACE2_Fc), а пустые лунки служили отрицательным контролем. Интенсивность сигнала измеряли в канале детектирования 635 нм (F635). Рассчитывали среднее значение F635 для каждого пептида и преобразовывали log2 для графического представления.

В качестве эталонной базы данных использовались последовательности шиповидных белков семи различных штаммов (Bat CoV RaTG13, коронавирус панголина, SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, MERS-CoV, Bat CoV RsSHC014, BAT CoV WIV1). Аминокислотные последовательности для Peptide ID (от S1-1 до S2-97) затем подвергали анализу в этой эталонной базе данных. Blastp-task blastp-short (blast-v2.2.29 +) использовали для поиска гомологии последовательностей между вирусными последовательностями и интересующим пептидом.70. Для нисходящего анализа сохраняли только верхнее совпадение для каждого представляющего интерес пептида. Если было два или более совпадения для одного пептида в штамме коронавируса, сохранялся тот, у которого была наибольшая длина выравнивания (12 пар оснований) и наименьшее ожидаемое значение. Сообщаемое E-значение, процентная идентичность и битовая оценка представляют собой средние баллы для всех семи штаммов коронавируса для каждого идентификатора пептида.

Синтез пептида S2-78

Были синтезированы две версии пептидов S2-78 (Creative Biolabs, Ширли, Нью-Йорк, США). Полноразмерный пептид S2-78 из 12 аминокислот был синтезирован для иммуноанализа. Кроме того, пептид S2-78 был синтезирован с конъюгированным белком-носителем дифтерийного токсина CRM197 для исследований иммунизации для повышения иммуногенности пептидной вакцины.

Иммунизация мышей вакциной, конъюгированной с пептидом SARS-CoV-2

Описанные ниже методы соответствуют рекомендациям ARRIVE (https://arriveguidelines.org) для отчетности об экспериментах на животных. Исследование на мышах проводили в Hooke Laboratories, Лоуренс, Массачусетс, США. Все методы были рассмотрены и одобрены организацией Hooke and Children’s Mercy IACUC и выполнены в соответствии с соответствующими международными рекомендациями и правилами по благополучию лабораторных животных. Мыши были получены от Taconic Biosciences, Rensselaer, NY, USA.

5 самок мышей BALB/c в возрасте от 7 до 10 недель иммунизировали подкожно 0,1 мл/мышь в дозе 37,5 мкг/мл пептида FKEELDKYFKNHC-CRM197 (Creative Biolabs), смешанного 1:1 с Addavax (VAC-ADX-10, Invivogen, Сан-Диего, Калифорния, США) в дни 0, 21 и 35. Сыворотку собирали в дни 0, 28 и 42. Исходный образец (день 0) использовали в качестве отрицательного контроля для каждой мыши. В этом исследовании не использовалась рандомизация или ослепление. Исходы на уровне антител определяли во временных точках во время иммунизации и тестировали на статистическую значимость с использованием непараметрических тестов из-за размера исследовательской выборки.

Мультиплексный анализ связывания вирусного антигена SARS-CoV-2

Для измерения уровней антител к белкам шиповидных субъединиц SARS-CoV-2, субъединице 1 шипа (S1), субъединице шипа 2 (S2) и рецептор-связывающему домену (RBD) использовали мультиплексный анализ на основе шариков на основе Luminex. Технология xMAP. Использовали наборы реагентов со вторичными антителами, специфичными к иммуноглобулину G (IgG) (HC19SERG1-85K, MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) в соответствии с производственным протоколом. Набор содержал набор шариков, конъюгированных с антигеном SARS-CoV-2 (S1, S2, RBD), а также 3 шарика положительного контроля и набор шариков отрицательного контроля. Гранулы положительного контроля представляли собой гранулы, покрытые различными концентрациями IgG. Гранулы отрицательного контроля не имели конъюгированного антигена для определения неспецифического связывания. 3 шарика, конъюгированных с антигеном, 3 шарика положительного контроля и 1 шарик отрицательного контроля смешивали и инкубировали с каждым образцом плазмы в разведении 1:100 буфером для анализа. Образцы запускали в двух повторностях. Каждый планшет содержал по крайней мере две лунки только с буфером и без плазмы для определения фоновой активности. Антитело для обнаружения конъюгата PE-анти-человеческий IgG использовали для определения гуморального ответа на каждый антиген SARS-CoV-2. Используя гранулы положительного контроля, коэффициент вариации (CV) между анализами (от планшета к планшету) был определен как 5,16% для IgG. Мы использовали анализатор Luminex (MAGPIX) и программное обеспечение для сбора данных Luminex xPONENT для сбора и анализа данных. После сбора чистый MFI рассчитывали путем вычитания фонового MFI (без плазмы).

После определения чистой MFI для всех образцов, индивидуумы перед вакцинацией на неделе 0 были сгруппированы на основе их связывания с S1, S2 и RBD и разделены на категории с низким (нижние 25 % связывания), средним (средние 50 % связывания) и высокий (верхние 25% связывания) для каждого антигена. Эти группы затем отслеживали по их ответу на 3-й неделе после вакцинации, чтобы определить, определяет ли первоначальное связывание с антигеном будущий ответ антител на каждый антиген.

Сбор комменсального кишечного бактериального белка из образца фекалий человека

Образец фекалий человека (D6323, Zymo Research, Ирвин, Калифорния, США) дважды центрифугировали при 200 g в течение 5 минут для удаления дебриса. Собирали супернатант и центрифугировали при 9000 g в течение 10 мин для сбора бактериального осадка. Осадок ресуспендировали в PBS с 1X Halt ингибитором протеазы и фосфатазы (78442, ThermoFisher, Уолтем, Массачусетс, США) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с с помощью ультразвукового зонда 3 раза. Концентрации белка измеряли с использованием набора для анализа белка Pierce BSA (23225, ThermoFisher).

Комменсальные кишечные бактерии ИФА

ELISA проводили с использованием бактериального лизата, собранного из образцов фекалий человека, разведенного до 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонате натрия, и инкубировали на чашках с высоким связыванием (3369, Corning) в течение ночи при 4 градусах. Сыворотку мыши разбавляли до 1:5 в суперблочном буфере с азидом натрия с последующими разведениями 1:10, 1:30, 1:90 и 1:270. Вторичные антитела были приобретены у компании Jackson ImmunoResearch: Goat anti-mouse IgG (Cat # 115-035-003, Lot # 153294). Вторичные разведения антител проводили в буфере суперблока без азида натрия в пределах диапазона рекомендаций производителя при разведении 1:50000. Добавляли субстрат SureBlue Reserve Microwell Substrate (95059-294, VWR) и инкубировали в темноте в течение 15 минут. Поглощение измеряли при 450 нм сразу после добавления в планшет 0,33 н. раствора HCl Acid Stop.

статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием Graphpad Prism 9.1. Для множественного сравнения статистическую значимость определяли с помощью критерия Вилкоксона – Манна – Уитни с двусторонним п ценности.

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.